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总结His抗体蛋白纯化的常见问题及解决方法

点击次数:216发布时间:2022-01-04
  His抗体能够特异性识别His标签,可以用于定性定量检测His融合蛋白的表达、细胞内定位等。为了让大家详细的了解该抗体,下面小编就介绍一下标签抗体进行蛋白纯化常见的问题及解决方法。
  
  His抗体蛋白纯化常见问题:
  
  一、蛋白不和介质结合
  
  可能原因:超声功率不合适(太大,蛋白碳化,太小,蛋白没完全释放)
  
  解决方法:改变超声功率或者其它方法破碎细胞。
  
  样品或缓冲液不合适
  
  解决方法:确保缓冲液中螯合剂,还原剂,咪唑浓度不是很高。
  
  His标签暴露不完全
  
  解决方法:在缓冲液中加变性剂(4-8M尿素,4-6M盐酸胍),然后用IMAC介质纯化。
  
  His标签丢失
  
  解决方法:必要时增加His的个数并确保正确表达,同时降低上样速度,确保足够的孵育时间。
  
  二、His抗体蛋白结合在介质上洗脱困难
  
  1、可能原因:洗脱条件太温和
  
  解决方法:增加洗脱咪唑浓度或降低pH。
  
  2、可能原因:蛋白沉积在介质上
  
  解决方法:减少上样量,优化层析条件。
  
  3、可能原因:非特异性结合
  
  解决方法:缓冲液加2%TritonX-100和NaCl。
  
  三、洗脱峰杂质多
  
  可能原因:非特异性结合,清洗不彻底,降解等。
  
  解决方法:纯化过程加蛋白抑制剂防止降解,上样完后要彻底清洗,加一定的NaCl和咪唑减少非特异性结合。
  
  四、使用几次,介质结合效率降低,柱效降低
  
  可能原因:介质上沉积大量杂质等
  
  解决方法:彻底清洗,IDA/IMAC脱镍再生处理。
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