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镍Ni柱L00666进行蛋白纯化的原理与使用方法

点击次数:53发布时间:2022-11-02
  镍Ni柱L00666是大家在蛋白纯化中,应用较多的一种纯化柱料,属于固定化金属离子亲和色谱中的一种,1975年由Porath等发明,其间不断完善发展至今。
  
  过渡金属通过与电子供体配基上,能与金属离子相互作用的羧基或氨基的电负性元素(O,N),形成较稳定的金属螯合物。在IMAC中,一个Ni2+有六个配位位点,被含有3,4或5个电子供体基团(配位位点)的螯合物固定在吸附剂上,而剩下未被占据的位点暴露于溶液中,能与组氨酸,半胱氨酸,和色氨酸的侧链或组氨酸标签的蛋白特异性结合。
  
  IMAC的螯合配基,常见有IDA(亚氨基二乙酸),NTA(次氮基三乙酸),TED(羧甲基乙二胺等,分别拥有3,4,5个配位位点与Ni2+结合,而空余的能与组氨酸标签结合的位点还剩3,2,1个。
  
  所以IDA与His标签蛋白结合力相对较强,特异性较弱,而TED则相反。我们在实际应用中通常选择载量与特异性适中的NTA类型。
  
  镍Ni柱L00666的洗脱通常采用竞争洗脱,先用低浓度的咪唑将杂蛋白和结合不牢的蛋白洗去,再用合适的浓度将目的蛋白洗脱。洗脱的先后顺序与蛋白的结合能力相关。
  
  另外,在镍Ni柱L00666的使用中,应当避免缓冲液中存在还原剂和螯合剂,以免Ni2+被还原而脱落。如果柱料使用太久积累了很多杂蛋白,可用EDTA将Ni2+螯合下来,再用NaOH清洗柱料后,重新螯合Ni离子,即可完成再生。平时不用时,应保存在20%乙醇中防止长菌。
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