镍Ni柱L00666在包涵体蛋白纯化中的应用探讨

更新时间：2026-10-19

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　　镍Ni柱L00666是利用固定化金属离子亲和层析原理，通过镍离子与组氨酸侧链的咪唑环配位结合来纯化蛋白的介质。在原核表达系统中，目的蛋白常以包涵体形式存在，镍柱纯化是获取高纯度目标蛋白的常用方法。探讨镍Ni柱L00666在包涵体蛋白纯化中的应用，需关注变性、复性和纯化条件的优化。

　　包涵体蛋白的纯化处理通常包括破菌、洗涤、溶解和纯化步骤。收集包涵体沉淀后，需用含变性剂的结合液重悬，建议优先使用尿素做变性剂，因为用盐酸胍的洗脱液需先除盐后才能电泳，而尿素洗脱液可直接跑SDS-PAGE。将重悬后的包涵体沉淀离心，取上清并用0.45微米滤膜过滤，去除未溶解的杂质，随后即可上镍Ni柱L00666进行纯化。

　　在纯化过程中，所用结合液和洗脱液均需含变性剂。上样后，采用咪唑梯度洗脱法，按从低到高的顺序洗涤并收集样品，通过SDS-PAGE电泳检测目标蛋白所在的区域。洗杂时咪唑浓度可在20至40毫摩尔之间摸索，以洗去大部分杂蛋白而不损失目标蛋白。洗脱时用250至500毫摩尔咪唑，若蛋白结合特别紧，可将咪唑提至1摩尔。

　　注意事项方面，整个实验需避免含巯基乙醇、DTT和EDTA等成分，因为它们会把镍离子扯下来，导致柱子失活。纯化结束后，分别用结合液、去离子水和20%乙醇洗柱一次，最后加20%乙醇将介质淹没，4摄氏度保存待下次使用。对于包涵体蛋白，推荐先复性再纯化，或采用变性液直接过柱的方式，但需注意不同变性剂对柱流速和蛋白活性的影响。

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