p-mTOR WB：大分子蛋白检测要点！！！

做 p-mTOR（磷酸化 mTOR）WB，最容易遇到的问题就是：
条带弱、背景高、重复性差，甚至磷酸化信号直接没了。
其实很多时候，不一定是抗体的问题，下面几个细节更值得注意👇

① 样本状态很重要
p-mTOR磷酸化水平容易受到培养条件影响。
建议设置好对照组，并尽量保持样本处理条件一致。

② 裂解要充分，但全程注意低温
mTOR 分子量较大，裂解不充分容易影响后续检测。
建议使用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的裂解体系，并尽量在冰上操作。

③ 上样前避免反复冻融
样品处理后建议及时分装保存，避免反复冻融造成磷酸化水平下降。

④ 大分子蛋白，电泳转膜是关键
mTOR 约 289 kDa，属于超大分子蛋白。
建议选择合适浓度的低浓度胶，并根据实际情况适当延长转膜时间。

⑤ 做磷酸化蛋白，全程都要注意保护
p-mTOR 容易发生去磷酸化。
从裂解到检测尽量减少室温放置，避免长时间操作和反复冻融。

⑥ 条带偏弱，不要只盯着抗体
大分子蛋白本身就可能存在转膜效率和检测灵敏度的问题。
可以从上样量、转膜条件、ECL 灵敏度几个方面逐一排查。
最后总结

p-mTOR WB 的核心就三点：
👉 大分子蛋白 → 转膜条件要优化
👉 磷酸化蛋白 → 全程低温保护
👉 信号偏弱 → 从样本、转膜到显色逐步排查